南宫28编辑按：近年来，基因编辑技术的快速发展为生命科学领域带来了颠覆性的变革，尤其是CRISPR-Cas13 RNA靶向系统在基础研究和应用科学中得到了广泛应用，成为科研人员的重要工具。然而，在哺乳动物细胞和小鼠模型中出现的旁切效应、体内靶向能力亟需提高以及不稳定的效率，限制了其在实际应用中的推广。今天，我们分享2025年3月由西班牙安达卢西亚发育生物学中心等研究团队联合发布于《Nature Communications》（IF=166）的一项新研究成果。该研究提供了一套经过验证的优化策略，显著提高了斑马鱼模型中RNA靶向CRISPR-Cas技术的效率和安全性，为CRISPR-Cas技术在生物医学应用中的进一步探索提供了新思路和方法。

研究背景

RfxCas13d是一种由黄化瘤胃球菌XPD3002分离出的CRISPR-Cas RNA核酸内切酶，它与向导RNA（gRNA）结合，通过RNA-RNA杂交靶向RNA。CRISPR-RfxCas13d系统在消除RNA方面显示出巨大的潜力，在生物技术和医学领域也广受关注。研究者近期通过核糖核蛋白（RNP）复合物或mRNA-gRNA递送技术，在体内优化了CRISPR-RfxCas13d技术，使其在斑马鱼及其他动物胚胎中能实现有效且瞬时的细胞质mRNA敲降（KD）。然而，研究发现了一系列需要解决的问题，如晚期基因靶向效率低、部分体外转录gRNA的毒性等，有助于进一步拓展CRISPR-RfxCas13d系统在体内的应用潜力。

研究结果

CRISPR-RfxCas13d向导RNA优化

研究表明，CRISPR-RfxCas13d在靶向内源性和早期转录mRNA时显示出较高的活性，但在受精后7-8小时，其基因表达效率下降。研究人员采用化学修饰的gRNA（cm-gRNA），显著提高了CRISPR-RfxCas13d在斑马鱼胚胎中后期合子基因mRNA的敲降效率，从而克服了RNP复合物的局限。此外，研究发现体外转录的gRNA在斑马鱼胚胎中可能引发毒性反应，探讨了毒性源于合成过程而非gRNA序列本身的可能性。

增强对核RNA的靶向能力

为提高核RNA的靶向能力，研究者对RfxCas13d进行了优化，发现一种带有核定位信号（NLS）的RfxCas13d（RfxCas13d-NLS）在斑马鱼胚胎中表现出有效的靶向和敲降能力。通过测试不同的NLS组合，研究确定了最佳方案，能够有效靶向斑马鱼胚胎中的核RNA并引起预期的发育表型和分子效应。

基于计算模型的活性预测

通过使用基于RfxCas13d和gRNA数据建立的计算模型，研究者验证了约200个gRNA在斑马鱼胚胎中的体内活性，结果显示，部分计算模型能够有效预测gRNA的活性，提供了筛选高效gRNA的重要工具。

CRISPR-RfxCas13d的附带活性

研究发现，CRISPR-RfxCas13d靶向高丰度外源报告基因时，往往伴随出现显著的附带活性，而针对斑马鱼胚胎内源性mRNA则显示出较低的附带性作用，突显了其在生物医学应用中的潜力和安全性。此次研究揭示了瞬时CRISPR-RfxCas13d的关键特性，促进了其在生物技术及医学研究中的有效应用。

总结

本研究通过多种优化策略，显著提高了CRISPR-Cas13d在斑马鱼模型中的瞬时RNA靶向效率、特异性和安全性。研究结果为避免潜在毒性、提高靶向效率等问题提供了重要的见解和替代方案，这对生命科学研究尤其是生物医学领域的应用将产生深远的影响。

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