二、TOPO克隆PCR产物的纯化回收

1. PCR反应完成后，需进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确认是否存在目标大小的条带。

2. 推荐采用切胶回收的纯化方式，切胶时间尽量控制在3分钟内，以避免紫外线对DNA造成损伤。回收浓度可借助NanoDrop或OneDrop等仪器检测，浓度应≥30ng/μl，并需再次跑胶以确认仅存在目标条带。

3. 将目标片段连接至载体：连接反应体系需按照说明书要求操作，各成分体积应≥1μl；若浓度过高可进行适当稀释。连接反应温度可尝试设定为25°C或37°C，持续时间为5分钟；若克隆不佳或出现空载体/假阳性情况，可尝试延长至30分钟。

4. 感受态转化涂板的准备：选择使用DH5α、Fast-T1等用于克隆的化学感受态细胞。务必注意，感受态细胞不可重复冻融，-80°C冻结后建议一次性使用。

5. 重组产物与感受态细胞的体积比例应为1:10，推荐将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或5μl重组产物加入至50μl感受态细胞。

6. 热激时间按照感受态细胞说明书进行操作，平板抗生素的抗性需与转化载体的抗性保持一致。

7. 涂板的菌液体积：将菌液离心（2500×g，3分钟），移去多余LB培养基，保留100μl重悬液后全部涂布，或吸取适当体积进行涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1. 挑取平板中大小适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落。

2. 对挑取的多个单克隆菌落进行鉴定分析。

3. 将采集的菌落放入已加入10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中，充分溶解混匀后吸取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）模板。

4. 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。

如模板中存在Amp/kana抗性的质粒，需对目标片段进行切胶回收。

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