蛋白质纯化在生物医疗领域是一项至关重要的技术，旨在从复杂的生物样品中提取特定蛋白质。以下是主要的纯化方法和相关注意事项：

1. 选择性吸附分离

通过利用不同蛋白质颗粒对特定吸附剂的吸附能力来实现目标分离。例如，某些蛋白质可能会选择性地吸附在活性炭或硅藻土等吸附剂上，而其他杂质则不会或吸附较弱。利用洗脱技术，可以将目标蛋白质从吸附剂中分离出来。

2. 亲和层析

依据蛋白质分子与特定配体之间的生物特性相结合的原则。将含有目标蛋白质的样品通过装有与该蛋白质特异性结合的配体层析柱，目标蛋白质与配体结合，其余杂质随洗脱液流出。随后，通过特定的洗脱液可以提取目标蛋白质，实现其纯化。

3. 低温有机溶剂沉淀法

利用如甲醇和乙醇等可与水混溶的有机溶剂，在低温下降低大多数蛋白质的溶解度以使其析出。尽管该方法相较于盐析具有更高的分辨率，但蛋白质易变形，因此需要严格控制温度条件。

4. 按分子大小分离

a. 密度梯度离心

在介质中对蛋白质进行离心时，蛋白质的沉降速度与其质量和密度有关。通过在离心管中形成密度梯度介质，不同大小的蛋白质在离心力的影响下会分布在不同的密度区域，实现分离。

b. 凝胶过滤

这种柱层析方法利用具有特定孔径的凝胶颗粒填充层析柱。混合蛋白质样品通过凝胶柱时，小分子蛋白质能够进入颗粒的孔隙，而大分子则被排斥在外，从而实现不同大小的蛋白质分离。

c. 超滤

该方法利用蛋白质分子无法通过半透膜的特性，在压力或离心条件下，让小分子物质穿过膜，而蛋白质分子被截留，从而实现分离和浓缩目标蛋白质。

5. 按溶解度差异分离

a. 等电点沉淀法

在蛋白质的等电点时，分子间的静电斥力减少，容易聚集沉淀。通过调节溶液的pH值至蛋白质的等电点，能使目标蛋白质沉淀，有效实现与其他杂质的分离。

b. 盐溶与盐析

该方法通过使用一定浓度的盐溶液来改变蛋白质的溶解度。在低盐浓度下，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的提高而增加，而在高盐浓度下则会减少，导致蛋白质析出沉淀，从而达到分离的目的。

6. 按电荷不同分离

a. 离子交换层析

该方法基于蛋白质分子表面电荷与离子交换剂之间的相互作用。带正电荷的蛋白质会与阴离子交换剂结合，而带负电荷的蛋白质则与阳离子交换剂结合。通过改变洗脱液的离子强度或pH值，可以依次洗脱结合在离子交换剂上的蛋白质，实现分离。

b. 电泳分离

在电场作用下，蛋白质分子根据其电荷性质和数量在凝胶或其他介质中向相反电极移动。不同的蛋白质由于电荷、尺寸和形状的差异，其在电场中的迁移速度各异，从而实现分离。常见的方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。

7. 蛋白质纯化时的注意事项

为确保纯化的成功，需遵循以下事项：

• 防止蛋白质变性：避免剧烈搅动和反复冻融，尽量在低温下操作，以保护蛋白质的稳定性和活性。
• 模拟细胞内环境：缓冲溶液应尽量模拟细胞内环境，保持适宜的pH值和离子强度。
• 防止氧化：添加适量的抗氧化剂，如0.1-1 mmol/L二硫苏糖醇，以避免蛋白质氧化。
• 避免重金属破坏：应用金属螯合剂如1-10 mmol/L EDTA，保护目标蛋白免受重金属影响。
• 防止微生物污染：通过使用灭菌溶液以防止微生物生长对蛋白质的影响。
• 控制蛋白浓度：确保蛋白浓度适中，避免聚集或变性。
• 重视pH值：除非进行聚焦层析，否则需选择合适的pH值，防止蛋白沉淀。
• 抑制蛋白酶活性：使用蛋白酶抑制剂以防止目标蛋白降解；纯化过程中可加入DNA酶以避免DNA污染。
• 实验操作细节：进入纯化系统的所有溶液应在当日经过0.22 μm膜过滤和脱气处理。

通过遵循以上步骤和注意事项，使用南宫28品牌的技术，可以高效且安全地进行蛋白质纯化，从而为生物医疗研究提供坚实的基础。