## 第三章：实时荧光定量PCR的应用

### 一、相对定量测定不同样品中基因表达量的相对值

内参基因的选择在实时荧光定量PCR中至关重要，直接影响结果的有效性。选择内参基因时需遵循以下原则：

• (1) 选择表达丰度高且稳定的基因作为内参基因；
• (2) 避免盲目选择常用的内参基因；
• (3) 常用的内参基因包括GAPDH、Actin和Tublin。

在加入内参基因后，可以进行结果的计算，以获得各样品中基因表达的相对值。

### 二、绝对定量

绝对定量通过标准品来测定样品中基因的绝对表达量（拷贝数）。标准品包括：

• A. 具有明确拷贝数浓度的克隆质粒；
• B. PCR产物；
• C. cDNA（扩增效率测定等用途，但不能用于绝对定量）。

拷贝数的计算依据平均分子量（MW）：

• dsDNA = (碱基数) x (660道尔顿/碱基)；
• ssDNA = (碱基数) x (330道尔顿/碱基)；
• ssRNA = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)。

拷贝数计算公式为：

(6.02 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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